В 1987 году группа учёных из Университета Осаки обнаружила у E.Coli странные повторы из 29 нуклеотидов, разделённые уникальными последовательностями ДНК. Они были названы CRISPR — кластеризованные, регулярно разделённые, короткие палиндромные повторы (теперь понятно, почему учёные так любят аббревиатуры!). Позже выяснилось, что это иммунная система бактерий: повторы — фрагменты вирусов, с которыми бактерия столкнулась в прошлом, но смогла победить, разрезав их ДНК. 

Эта статья была опубликована в журнале OYLA №12(28). Оформить подписку на печатную и онлайн-версию можно здесь.

В качестве трофея бактерия помещает определённый кусочек вирусного генома в свой. При следующей встрече клетки с вирусом происходит активация этих фрагментов — из них формируется РНК-проводник (РНК-гид), которая объединяется с бактериальной нуклеазой Cas9, аналогом ZFN и TALEN. Комплекс Cas9‑гРНК направляется к ДНК вируса и сканирует её, пока последовательность РНК-гида не совпадёт с определённым участком. После чего Cas9 нарезает вирусную ДНК, и клетке удаётся избежать заражения.

Cas9 — управляемая при помощи РНК-гидов эндонуклеаза, связанная с иммунной системой CRISPR. Комплекс Cas9‑гРНК направляется к ДНК и сканирует ее, пока последовательность РНК-гида не совпадет с определенным участком. После этого Cas9 разрезает ДНК.

Технология CRISPR/Cas9 «засветилась» в лечении малярии. Малярия — угрожающее жизни заболевание, которое вызывают и передают паразиты рода Plasmodium через укусы инфицированных самок комаров вида Anopheles. Иммунитет к малярии появляется только после нескольких заражений. Сегодня, как и 400 лет назад, основное лекарство против этой болезни — хинин, а более эффективные — слишком дорогие.

К идее о том, как бороться с малярией, учёные пришли после опытов на мушках-дрозофилах. Исследователи из Калифорнийского университета сообщили о том, что смогли вставить систему CRISPR/Cas в место разрыва, который был ей же и внесён. Учёные подсунули клетке для починки разрыва фрагмент, содержащий не только ген интереса (мутантный ген yellow, который приводит к жёлтой окраске туловища), но и РНК-гид и фермент Cas9.

При интеграции CRISPR/Cas9 комары будут иметь одну копию гена нуклеазы (NUC) и одну копию аллеля дикого типа. Вставка CRISPR/Cas9 «саморазмножается», поражая нормальную аллель, поэтому распространение мутантного аллеля в популяции будет происходить очень быстро.

Когда из модифицированной клетки развилась здоровая мушка женского пола, её скрестили с мушками-носителями нормальных генов. По ожиданиям учёных только 50% новорождённых самцов должны были иметь жёлтый окрас. Но оказалось, что почти все мушки родились с жёлтым телом. Вставленная вместе с геном система CRISPR/Cas распространилась по геномам потомства: Cas9 и РНК-гид упорно разрезали нормальный вариант гена yellow, полученный от другого родителя. Этот метод получил название — мутагенная цепная реакция.

Подобным образом можно бороться и с малярией. Ген, который необходимо встроить, кодирует антитело, которое будет защищать организм комара от малярийного плазмодия — возбудителя малярии. Чтобы не выпускать огромное число комаров, имеющих такую встройку, учёные предлагают добавить CRISPR/Cas-систему прямо в геном, чтобы модифицированные комары быстрее распространили ген, кодирующий спасительное антитело.

Все существующие системы редактирования генов имеют свои плюсы и минусы. Проблема ZFN в том, что результат её использования непредсказуем. ДНК-связывающие элементы влияют друг на друга, что уменьшает эффективность и точность разрезов. Требуются многократные проверки, подтверждающие, что система работает, как нужно.

TALEN имеет меньше ограничений в работе. ДНК-связывающий элемент распознаёт последовательность ДНК, независимо от других — это увеличивает специфичность связывания. А новую TALE-нуклеазу можно создать за одну неделю.

Нуклеаза CRISPR/Cas9 имеет чуть меньшую точность по сравнению с TALE. Однако создание этой системы занимает всего несколько дней: не нужно каждый раз синтезировать новые белки — только РНК. Именно поэтому на сегодняшний день CRISPR/Cas9 — самый выгодный компромисс между качеством и доступностью для исследований.